Metoda Inventarisasi OPT
Kegiatan ini menggunakan metode Survey, adapun kegiatan inventarisasi ini terbagi kedalam beberapa tahapan, yang terdiri dari :
- Pengamatan (surveillance)
- Pengambilan sampel
- Isolasi dan Identifikasi
- Pengawetan spesimen dalam koleksi
- Pelabelan
- Dokumentasi
Pengamatan (Surveillance)
Hal pertama yang dilakukan adalah menentukan menentukan parameter pengamatan, beberapa parameter yang diamati adalah :
a. Umur bibit
Umur bibit tanaman kakao sekitar
Umur bibit tanaman kopi kurang dari setahun (Bibit dari perkecambahan biji) dan 3 – 8 bulan (Bibit sambungan) (Anonim, 2006).
b. Tempat pembibitan
Bibit tanaman kopi dan kakao kadang tidak ditanam di persemaian yang khusus, tetapi sebagian petani menggunakan tempat yang ada sebagai pembibitan. Oleh karena itu tempat pembibitan disini disesuaikan dengan keadaan di lapangan mengacu pada umur bibit tanaman.
c. Bagian tanaman yang diamati
- Akar
Untuk tanaman kopi khususnya, terdapat nematode yang menyerang perakaran dari pembibitan sampai dewasa, oleh karena itu perlu dilakukan pengamatan dari bagian perakaran.
- Batang / cabang
- Daun
Metode pengambilan sampel
Area pengambilan sampel dilakukan dengan mempertimbangkan keadaan populasi tanaman di lapangan, yang diperkirakan dapat mewakili tanaman secara keseluruhan jika memungkinkan. Dalam kegiatan ini dibatasi areal pengambilan sampel 20 % dari populasi tanaman yang ada.
Untuk pengambilan sampel patogen tanaman ada beberapa hal yang harus diperhatikan :
a. Diusahakan bersamaan harinya dengan pengiriman sampel tersebut untuk ditangani di laboratorium.
b. Pilih sampel pada garis batas antara bagian tanaman yang sakit dan yang sehat.
c. Apabila dicurigai akar sebagai masalah, ambil tanah dan jaringan batang bawah beserta sampel akarnya.
d. Tempatkan sampel pada kertas koran jika sampel masih akan memakan waktu lama untuk ditangani di laboratorium. Sampel ditempatkan pada kantong plastik yang dapat ditutup rapat dan taruhlah kertas tisu kering atau kertas pengering untuk mengisap kelembaban yang berlebihan jika sampel akan segera ditangani di laboratorium
e. Jangan menambahkan kelembaban atau membungkus sampel basah.
f. Jangan biarkan bahan sampel mengering.
g. Pelabelan
Untuk pengambilan sampel serangga relatif lebih mudah dalam penanganan tetapi membutuhkan keahlian dalam pengumpulannya, karena serangga sifatnya aktif dan bisa berada dimana saja pada bagian tanaman ataupun diluar bagian tanaman. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam pengambilan sampel serangga di lapangan:
a. Serangga yang aktif dikumpulkan dengan cara ditangkap menggunakan alat berupa sweeping net.
b. Serangga yang telah ditangkap kemudian dimatikan dalam killing bottle yang berisi chloroform.
c. Serangga dikumpulkan pada toples plastik berventilasi untuk sementara sebelum ditangani di laboratorium.
d. Apabila mengirimkan serangga kecil dan/atau tubuhnya lunak (seperti, trips, kutu daun, tungau, dan larva), tempatkan spesimen ke dalam 65% etil alkohol-35% air dan isilah wadah sampai penuh.
e. Serangga yang dikumpulkan dalam keadaan mati untuk keamanan saat membawa dari lapangan. Tetapi ada beberapa serangga yang mungkin diambil secara hidup, misalnya ketika serangga tersebut masih dalam stadia larva atau nimfa dan kemungkinan kita membutuhkan serangga tersebut untuk ditumbuhkan sampai imago untuk mempermudah identifikasi.
Setelah kembali dari lapangan, spesimen sampel sebaiknya segera dipilah-pilah berdasarkan ketahanan sampel tersebut. Prioritas perlu diberikan kepada spesimen yang cepat memburuk, seperti jamur makro yang berdaging atau spesimen-spesimen yang patogennya harus segera diisolasi dari jaringan tanaman. Bakteri dan jamur patogen seringkali harus diisolasi dan dikulturkan dari specimen tanaman berpenyakit sebelum dapat diidentifikasi. Patogen yang dapat tumbuh saprobik (parasit fakultatif atau nekrotrof) umumnya dapat ditumbuhkan dalam kultur, walaupun beberapa di antaranya memerlukan perlakuan khusus
a. Isolasi
- Persiapan Isolasi
Banyak jamur dan bakteri saprobik tumbuh pada atau mengkontaminasi jaringan tanaman sebagai pengkoloni sekunder luka penyakit. Oleh karena itu, penting sekali untuk berhati-hati ketika menggunakan teknik steril guna menghindari terjadinya kontaminasi. Sterilisasi permukaan jaringan yang dipotong seringkali diperlukan untuk menghilangkan mikroorganisme saprobik yang biasanya tumbuh di permukaan tanaman.
Sterilisasi permukaan material tanaman yang sakit menghilangkan saprob dan memungkinkan bakteri atau jamur patogen untuk tumbuh tanpa gangguan bila material dilapiskan pada agar-agar. Etanol (70%) yang digunakan untuk menyeka permukaan atau merendam dapat mensterilkan seluruh permukaan. Tidak diperlukan pencucian pasca perlakuan, karena dapat tanpa dibakar atau dibiarkan menguap. Natrium hipoklorit cair juga banyak digunakan dan sangat efektif sebagai desinfektan. Pemutih komersial mengandung 10–14% klorin tersedia. Ini biasanya digunakan pada pengenceran 10% (mengandung 1–1,4% klorin tersedia) dengan waktu pencelupan 1–5 menit. Larutan ini sebaiknya disimpan di dalam lemari es, karena kemampuannya akan hilang bila disimpan lama. Larutan encer yang baru sebaiknya dibuat lagi setiap 2–3 minggu (Shivas & Beasley, 2005).
-
IIsolai Jamur
Prosedur dasar untuk mengisolasi jamur patogen dari jaringan tanaman adalah sebagai berikut (Shivas & Beasley, 2005):
1. Cucilah contoh jaringan di bawah air leding yang mengalir untuk menghilangkan tanah, debu, dan kontaminan lainnya;
2. Bila contoh terlalu banyak ditumbuhi saprob, sekalah dengan etanol 70%. Hal ini dianjurkan untuk mensterilkan permukaan jaringan kayu yang sakit;
3. Irislah jaringan dari tepi utama luka yang berbatasan dengan jaringan yang sehat;
4. Letakkan irisan-irisan jaringan ke dalam larutan natrium hipoklorit 1% dalam etanol 10%. Hal ini perlu disesuaikan bergantung kepada sifat jaringan, karena misalnya, beberapa jaringan daun sangat berpori dan mungkin dapat mengabsorbsi cukup banyak larutan sterilan untuk dapat mematikan patogen. Waktu pencelupan untuk sterilisasi biasanya antara 1–5 menit;
5. Keluarkan irisan-irisan jaringan dari larutan untuk mensterilisasi dan cucilah dengan cara memindahkannya sebentar ke dalam air suling steril. Kemudian irisan-irisan tersebut sebaiknya dikeringkan di atas kertas saring steril, apabila memungkinkan, dilakukan di udara yang disaring dalam ruang isolasi (laminar flow), sebelum mengiris potongan jaringan kecil (kira-kira 2 mm x2 mm) yang dilapiskan pada agar-agar air leding atau agar-agar dekstrosa kentang. Pengeringan penting, karena menghambat pertumbuhan bakteri kontaminan. Ketika melapiskan potongan jaringan pada media agar-agar, tutup cawan Petri sebaiknya diangkat dan ditaruh kembali dengan hati-hati untuk menghindari masuknya kontaminan yang berasal dari udara;
6. Pelat isolasi sebaiknya diinkubasi dengan posisi terbalik untuk mencegah kondensasi uap air pada permukaan agar-agar. Kebanyakan jamur pathogen tumbuh dengan baik pada suhu 25°C;
7. Kultur murni dapat diperoleh dari koloni yang berasal dari spora tunggal atau dari ujung hifa yang terdapat pada pelat isolasi awal. Kultur spora tunggal dapat dibuat dengan menyiapkan suspensi spora dalam air suling steril dan disebarkan di atas agar-agar air leding atau media lain yang sesuai. Pelat-pelat ini kemudian diinkubasikan di dalam ruang gelap pada suhu kamar selama 24 jam. Selanjutnya pelat-pelat itu diperiksa di bawah mikroskop stereo dan spora-spora tunggal yang berkecambah pada sepotong kecil agar- agar dipindahkan dengan jarum inokulasi ke media yang sesuai;
8. Prosedur tersebut di atas dapat dimodifikasi sesuai dengan pengalaman atau mengikuti petunjuk yang tercantum dalam pustaka.
Dari daun
Pilihlah daun dengan bilur baru, karena jamurnya dalam keadaan paling aktif. Secara hati-hati, irislah potongan kecil jaringan dari bagian tepi bilur dengan gunting atau skalpel steril. Sterilisasi permukaan material daun biasanya perlu dilakukan, 1–3 menit dalam larutan natrium hipoklorit 10%, dilanjutkan dengan pembilasan dengan air steril. Selanjutnya, potongan-potongan daun ditaruh pada permukaan agar-agar dengan menggunakan pinset steril.
Dari batang
Bila terdapat bilur yang dalam atau bilur di bagian dalam jaringan pembuluh, contoh dapat diambil dari jaringan bagian dalam untuk menghindari diperlukannya sterilisasi permukaan. Contoh dibelah membujur dari bagian yang sehat ke arah bagian yang sakit dengan menggunakan pisau yang telah dibakar atau dengan alat lain yang sesuai untuk material berkayu.
Dengan menggunakan skalpel steril, pindahkan jaringan-jaringan dengan hati-hati dari tepi utama luka ke permukaan bagian dalam yang baru disingkap. Dengan menggunakan pinset steril pindahkan potongan jaringan yang panjangnya 3–5 mm ke cawan Petri yang berisi media agar-agar air leding atau media agar-agar lain yang sesuai. Pada batang yang tipis, biasanya bilur terbatas pada jaringan luar, atau tidaklah mungkin untuk mengambil contoh jaringan bagian dalam. Dalam hal ini, potongan-potongan kecil jaringan sebaiknya diambil dari tepi bilur dengan menggunakan skalpel steril, permukaan disterilkan (1–3 menit dalam natrium hipoklorit 10%), dicuci dengan air steril, dan disimpan pada permukaan agar-agar.
Dari akar
Cucilah akar-akar yang kecil dan halus untuk menghilangkan tanah yang berlebihan, kemudian taruhlah di dalam mangkuk yang bagian dasarnya rata atau cawan Petri berisi 2–3 cm air, sehingga bagian akar yang berpenyakit mudah dilihat. Pisahkan akar-akar itu dengan skalpel atau sepasang pinset. Selanjutnya, potonglah bagian akar yang mengarah ke tepi luka/bilur (sebaiknya panjangnya sekitar 5 mm) dengan menggunakan skalpel atau gunting steril. Sterilisasi permukaan juga dapat dilakukan sebentar, tetapi dengan material yang halus seperti itu, cara pencucian yang lama mungkin yang terbaik. Hal ini dapat dilakukan dengan menaruh potongan-potongan akar dalam saringan yang halus di bawah air leding bersih yang mengalir secara perlahan selama 30–90 menit. Selanjutnya, dengan menggunakan skalpel atau sepasang pinset steril, pindahkan potongan akar ke cawan Petri yang berisi media TWA (atau media agar-agar lain), dengan menaruh potongan-potongan ke dalam permukaan agar-agar.
Kadangkala gejala penyakit tampak jelas, tetapi patogen penyebabnya ternyata sulit diisolasi. Bila hal ini terjadi, material tanaman dapat diinkubasi di dalam wadah lembab untuk merangsang pembentukan tubuh buah dan sporulasi. Kendalanya, saprob yang terdapat pada permukaan tanaman juga dirangsang pertumbuhannya.
Penyekaan permukaan material sekilas dengan alkohol teknis atau larutan natrium hipoklorit 10% mungkin dapat menolong, tetapi dapat merusak struktur permukaan patogen yang ada. Cara lain, spesimen dapat juga dicuci dengan air steril dan dikeringkan sebelum inkubasi.
Wadah lembab sebaiknya diinkubasi pada suhu di bawah 25°C dan yang terbaik disimpan di tempat yang terang, misalnya di meja laboratorium, namun tidak langsung terkena sinar matahari dan pada suhu yang diusahakan tetap untuk menghindari kondensasi. Wadah ini harus diperiksa setiap hari, diamati di bawah mikroskop stereo dengan perbesaran rendah untuk melihat sporulasi. Selanjutnya, struktur spora dapat dipindahkan dengan menggunakan jarum halus yang steril untuk pemeriksaan mikroskopik yang lebih teliti atau untuk dikulturkan pada media agar-agar.
- Isolasi Nematoda
Metode ekstraksi nematoda ada yang aktif, bertumpu pada gerakan nematoda, atau pasif, dengan memisahkan nematoda berdasarkan ukuran dan kerapatan. Metode paling sederhana untuk ekstraksi nematoda aktif ialah dengan menggunakan penampan Whitehead atau corong Baermann.
b. Identifikasi
Identifikasi OPT dilakukan dengan membandingkan gejala pada tanaman, specimen OPT dan keterangan lainnya dengan literatur. Untuk hama tanaman identifikasi dilakukan dengan melihat ciri-ciri fisiknya, sedangkan untuk pathogen maka dilihat pertumbuhan pada media, meliputi bentuk dan warna koloni, serta pengamatan secara makro dan mikroskopis.
2.4. Pengawetan specimen dalam koleksi
a. Koleksi Hama
Sampel hama dari lapangan dikoleksi secara basah dengan menggunakan etil alcohol (70-80%). Jika sampel hama diperoleh dalam jumlah banyak maka dapat juga diawetkan secara kering dengan dilakukan perentangan pada kotak koleksi serangga.
b. Koleksi Patogen Tanaman
Koleksi pathogen tanaman berupa gejala pada daun dapat diawetkan secara basah dalam larutan FAA dan Tembaga Sulfat. Koleksi pathogen tanaman dalam bentuk kultur di media agar.
Pelabelan
Pelabelan penting untuk dilakukan sebagai data dasar dari koleksi hasil inventarisasi. Data pada label meliputi :
1. Nama OPT
2. Tanaman Inang
3. Bagian yang diserang
4. Gejala yang ditimbulkan
5. Lokasi pengambilan sampel (alamat sebenarnya, koordinat dari GPS)
6. Nama kolektor
Pendokumentasian
Dokumentasi kegiatan inventarisasi penting dilakukan untuk merekam seluruh kegiatan yang dilakukan, dokumentasi yang dimaksud meliputi :
1. Foto-foto dilapangan (gejala, serangga hidup dll)
2. Foto-foto penanganan di laboratorium
3. Foto-foto identifikasi dan koleksi
